imagej在生物图像处理中的应用


ImageJ软件在生物图像分析中 的应用 医学神经生物学国家重点实验室 神经生物学系 张雯婷 2015年1月7日 常 见 的 图像处理技术 1.灰度增强 2.伪彩色处理 3.阴影校正 4.平滑处理 5.锐化处理 6.分割处理√ 7.边缘检测 分割处理及其原理 1 . 像素分类  图像分割是把图像分成若干个按图像的某种特性(如灰度级,纹理等) 的区域这样一种处理技术。在每一个区域内都有相同或相近的特性,而相 邻区域内的特性则不相同。  图像分割从本质上讲是将各像素点进行分类的过程。分类所依据的 特性可以是图像像素点的灰度值、颜色或多谱特性、空间特性或纹理特性。  门限化操作进行分类的过程是基于下列一个假设:每个区域是由许 多灰度值相近的像素点所构成的,物体和背景之间或不同物体之间的灰度 值都有着明显的差别,从而可以通过门限化操作来加以区分。 待分割图像的特性愈接近于这个假设,用这种方法分割的效果就愈 好;否则,效果就愈差。 2 . 门限化 从输入设备中获取的灰度图像(或彩色图像), 是一种多值图像(对于8位数字图像来讲,其灰 度可取256个不同数值),如果直接在其上面进 行诸如面积、周长等颗粒特征参数的检测比较困 难。 对于符合上述假设的图像来讲,在作具体检测 前,通常首先要对它进行门限化操作以求得它的 二值图像。 门限化操作的具体方法: 设有一幅灰度图像g(m,n),其灰度等级的范围为[z1,zk](例如[0,255]), t是z1和zk之间的某一个数,则设置门限(又称阈值)t的操作是对g(m,n)的每一 个像素点的灰度值进行检测,并根据下列关系创建另一幅二值图像gt(m,n)(其 内只有0、1二种灰度值。注意:这里的0、1是逻辑值,而不是具体数值,所以 gt(m,n)是一幅逻辑图像):    t>n) g(m,0 18)-(2 N)0,1,2=n M;0,1,2=(m t<=n) g(m, 1 =n) (m,gt if if  这种门限化操作是假定图像g(m,n)内的阳性颗粒暗于背景,通常情况下, 这个假定总是成立的。 通过上式操作可得一其的合适的二值图像gt(m,n)。 若阳性颗粒亮于背景(例如荧光激发的样品图像就是这种情况),则应通过下 式操作得其的二值图像gt(m,n) :    t=n) g(m, 1 =n) (m,gt if if  上述操作可分别用图 (a)、(b)来表示。 若阳性颗粒内的各像素点的灰度值是介于门限t1、t2之间(灰度值低于t1的往往 是切片样品中的污物,而高于t2的通常是背景和其他非阳性颗粒内的像素点),则 必须通过式(2-20)操作得其的二值图像gt(m,n):    otherwise if 0 20)-(2 N)0,1,2=n M;0,1,2=(m t<=n) g(m,<=t 1 =n) (m,g 21 t  此操作如图 (c)所示 3. 门限选择 对于阳性颗粒较暗、背景较亮的图像  如果门限定得太高,则因有一部分背 景像素点被归入颗粒而使在所形成的二值 图像中的颗粒显得太“胖”(如图 (b) 所 示)  如果门限定得太低,如果门限定得太 低,则因有一部分颗粒像素点被归入背景 而使在所形成的二值图像中的颗粒显得太 “瘦”(如图 (c)所示) 门限t的正确选择对于正确检测目标至关重要。 合适门限选择的依据——灰度直方图  如果图像内只含有一种类型的阳性 颗粒,且其比较暗,而背景比较亮 (反之亦然),其灰度直方图呈典型 的双峰形状,在两峰之间存在着一个 谷点。  取该谷点位置上的灰度值作 为门限,并以此为界将图像 中的全部像素点分为二部分: 谷点左侧的为阳性颗粒 谷点右侧的为背景 分别给于标记(某 种颜色),获得只 含有二种标记(阳 性颗粒和背景)的 分割图像。 确定门限的理论依据是: 由于图像的灰度直方图通常呈正态分布,根据贝叶斯最佳判别准则,门限只 有选在二个分布函数曲线的交点上,才能使所产生的判别误差最小(其值等于图 中的阴影部分面积)。 如何进行图像分析? 2、你想获得哪些数据参数? Area, Number of particles, Intensity, Size/distribution of particles, Length etc 1、你的图像是什么性质?彩色图像还是灰度图像? 3、你想要测定的整幅图像还是某个特定区域?如 何将你选定的ROI应用于其他图像? 4、如何分开重叠的颗粒? Split channels, Color thresholding, Convert to 8bit grayscale etc ROI manager Watershed ImageJ 软件简介 • ImageJ软件是由美国国立卫生研究院(National Institutes of Health ,NIH)所属的国家精神健康中心(NIMH)的Wayne Rasband开发 的一个基于Java的公共的图像处理和分析程序。目前,可以运行于 Microsoft Windows, Mac OS,Mac OS X,Linux和Sharp Zaurus PDA等多种平台。 • ImageJ支持图像栈功能,即在一个窗口里以多线程的形式层叠多个 图像, 并行处理。 • ImageJ是免费、开放和多平台支持的软件,这成为该软件在世界范 围内科学研究领域广泛应用的重要原因。 • 不断更新的插件Plugins可以满足用户的各种需求 • 下载地址:http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html. http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html 软件安装及运行 • 下载ImageJ软件包,安装软件(刚刚下载的ImageJ软件包可 能不是最新的版本,因此最好在首次下载安装ImageJ软件后 ,尽快对软件进行升级) • 与大多数图像处理软件不同,Image J软件打开后,没有主 要操作界面,而只出现一个命令对话框。 ImageJ软件的应用 • 测定面积 • 计算目标颗粒(细胞)的数目 • Western blot分析 • 测定长度 • 伪彩图 测定整体面积和ROI面积 • 打开需要分析的图像(8-bit,对于RGB图像需要进行split color操作) • 设定阈值Image>Adjust>Threshold (Auto) 对于荧光染色图像要勾选 dark background,红色部分为所设定的测定目标,按set键进行设定 ,apply进行确认应用。 • 设定参数,对免疫组化阳性表达的面积分布、百分比分布、积分光 密度、平均光密度、阳性细胞数量等参数进行量化。弹出Set measurements对话框(Analyze->Set measurements),选择上述所 要观察的指标,点击Ok确认 • 如果需要计算实际的阳性面积大小,可以设定图片的标尺 Analyze>Scale设定单位(pixel to μm…) • Analyze> Measure 获得计算结果 计算目标颗粒的数目(方法一) • 选择Point Selection • 选择标记细胞的标识所用的颜色 Edit>Options>Colors>Selection(显著区别于计数目 标的颜色) • 打开Edit>Options>Point Tool,在对话框中选定Auto -Measure(可以同时调整label的大小) • 点击选中的点将在Result窗口中显示其xyz的位置和 灰度值等参数 • 打开需要分析的图像(8-bit,对于RGB图像需要进行split color操作) • 设定阈值Image>Adjust>Threshold对于荧光染色图像要勾选 dark background • Process/Binary/Watershed将重叠的部分分开 • 设定计算参数Analyze>Set Measurements,勾选Display Label •Analyze> Analyze Particles设定显示结果(设定颗粒的最大值和最小值) • 在Results窗口中会看到对应每个点的相应参数(面积、xy的位置和直径 等)包括颗粒的数目 • 优点:可以获得更多关于计数颗粒的信息 • 缺点:一次只能针对一种类型进行分析,计数误差比较大 计算目标颗粒的数目(方法二) • 打开Plugins>Analyze>Cell Counter • 初始化initialize • 选定细胞的type,如type1,点击计数同类细胞 • 对于另外一种类型的细胞,可以选定type2,点击细胞进行计数 • Result显示每种类型中所计数到的细胞数目 • Measure会显示所有计数过的细胞的类型、位置和灰度值等参数 • 优点:可以同时计数同一幅图像中所存在的多种类型的细胞 计算目标颗粒的数目(方法三) 分析凝胶电泳图谱 (方法一) • 打开文件, 在Image>Type下点击8-bit将图像转换为灰度图像, • 在Process>Subtract Background,rolling ball radius的参数设定为 50,去除图像的背景 ,这个值越小,减去的背景色越多。 • Analyze>Set Measurements,勾选Area,Mean Gray Value和Integrated Density • Analyze>Set Scale,长度单位设定为pixel • Edit>Invert(或Ctrl+Shift+I)来反转图像中的颜色。此时,黑色区域变为白色,原来的 白色区域变为黑色,正如上面勾选出的,使得测定的数值随蛋白表达量的增加而增 加。 • 选择freehand工具 • 在第一条带的周边画圈,你需要自己判断条带的边界,将目的条带与背景区别开。 • 点击m键,计算所圈定区域的相关参数,结果将在弹出的result对话框中显示,所有 在第4步中选定的参数将在结果中显示。 分析凝胶电泳图谱 (方法二) • 打开文件, Analyze>Gels>Gel Analyzer选项,勾选对话框中的Percentages, Outline Lanes和Invert Peaks。 • 选择矩形选择框工具,在第一条带上画一矩形框(矩形框的高度大于宽度),包括目的条带 上下的一定区域。 • 点击1或Analyze>Gels>Select first lane,一个新的窗口将弹出,并出现新的选择框。 • 使用箭头工具将方框移到下一条带,按2(或Analyze>Gels>Select next lane)将选择框移动到 下一个条带,重复此项操作。 • 完成后,按3或选择Analyze>Gels>Plot Lanes,弹出一个每一条带的profile plot窗口。 • 选择直线选择工具,在每个峰的底部,画一直线,将峰变成一个封闭的区域,两侧为背景信 号,如果有很多条带,后面的lane将被隐藏在profile plot的底部,如果需要看到这些条带,可 以点击空格键,将鼠标向上拖动。 • 当所有的峰都封闭后,选择Magic Wand工具。 • 使用空格键和鼠标,拖动Profile Plot向下,使用Wand工具,点击峰的内部,重复此操作。 • 选定峰后,Analyze>Gels>Label Peaks,将会计算并标记每个波峰的面积百分比,此值即为该 电泳图谱上各个条带的含量百分比,然后在Results窗口中进行结果的复制和粘帖到Excel表格 中进行统计。 http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/ • 该软件是由Eric Meijering开发的,用于测量神经元突 起长度的插件 • 下载neuron J软件,复制到Image J软件的Plugins文件夹 中。 • 打开Image J,并在Image J中打开Neuron J 计算神经元突起长度 • 在Neuron J的界面中选择并打开所要分析的图像(file- >open),需要强调的是,Neuron J只能打开8-bit的图像 ,如果原始图像不满足该要求,最好先用Image J打开图 片,将其另存为8-bit的图像用于Neuron J分析。 • 点击Add tracings键,将所要计算长度的突起用线画出。 • 设定图片的标尺(Analyze->Set scale) • Analyze->measure结果中的长度就是突起的实际长度
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pdf贡献者

niezheng

贡献于2016-11-28

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